1.  引言

高濃度制劑是指最終的單抗蛋白濃度大于100 mg/mL的制劑。目前，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的單抗產(chǎn)品中有大約三分之一是高濃度制劑（＞100mg/mL）。^[1]高濃度制劑可降低西林瓶的灌裝體積，節(jié)約生產(chǎn)成本，減少注射時間，提高患者依從性。

注射劑中的顆粒檢測是注射劑質(zhì)量控制的重要項目，影響著注射劑的安全性及有效性。顆粒主要包括可見顆粒和亞可見顆粒（sub-visible particle，SbvP），美國藥典USP<788>和中國藥典CP0903中均對注射劑亞可見顆粒（不溶性微粒）的檢測方法和限度進(jìn)行了明確的規(guī)定。針對抗體注射劑，美國藥典USP<787>和USP<1787>對其亞可見微粒進(jìn)行了補充說明。

與常規(guī)注射劑相比，高濃度抗體藥物制劑具有注射體積小（通常為2mL）^[2]等特點，現(xiàn)有檢測方法在檢測小容量的單劑量包裝樣品具有一定的局限性；高濃度抗體藥物制劑的理化性質(zhì)相較于常規(guī)注射液也出現(xiàn)了變化，蛋白質(zhì)濃度的增加使短距離相互作用的影響越來越大，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用變得顯著，增加了制劑的黏度。黏度、流動性差等特點使其在亞微粒檢測混合和抽取時有一定影響；由于高濃度抗體制劑的分子間結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜，更易產(chǎn)生自締合（Self- association）和聚集（Aggregation），相較于常規(guī)SbvP檢測的光阻法，流動成像法因可區(qū)分某些類型的顆粒而廣泛應(yīng)用于聚集體的檢測。

2.  顆粒粒徑/計數(shù)技術(shù)

高濃度抗體藥物制劑的顆粒來源主要有三類：

1）外源性顆粒，指與生產(chǎn)工藝及產(chǎn)品成分無關(guān)的顆粒；

2）內(nèi)源性顆粒，來源于生產(chǎn)原料、包材以及生產(chǎn)工藝的操作中所產(chǎn)生的亞可見微粒，如膠塞上脫落的碎片、預(yù)充針的硅油涂層和玻璃碎片等；

3）固有性顆粒，即產(chǎn)品自身產(chǎn)生的顆粒，如蛋白聚集與表面活性劑膠束形成的顆粒。

由于存在多種潛在的顆粒來源，因此識別顆粒并確定顆粒來源有利于產(chǎn)品開發(fā)和應(yīng)用評估。如果研發(fā)時測試結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)限度出現(xiàn)偏差，顆粒識別將指導(dǎo)原因分析、風(fēng)險評估、糾正措施、調(diào)整控制策略等多個環(huán)節(jié)。^[3]

美國藥典推薦使用光阻法作為檢測抗體注射劑中不溶性微粒的檢測的方案[4],相較于常規(guī)的注射劑，高濃度抗體注射劑在使用光阻法需注意：

1）粒度分布的分析取決于所使用的儀器及其校準(zhǔn)方法，目前常用于校準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)粒子均為球體，但蛋白質(zhì)顆粒通常具有不規(guī)則的形態(tài)，等效球體模型下可能會對蛋白質(zhì)粒徑檢測有一定的影響。

2）小體積檢測分析方法開發(fā) 高濃度抗體注射劑具有注射體積小的特點，無法直接用于常規(guī)儀器的檢測，需將幾個樣品混合獲得可供測試的樣品，美國藥典USP<788>規(guī)定需混合得到25ml的樣品，每次取樣5mL,共檢測4次，統(tǒng)計≥10μm 和≥25μm的顆粒濃度，舍去第1次測定結(jié)果，取剩下3次測定結(jié)果平均值為最終結(jié)果。

此外美國藥典USP<787>中專門針對治療性蛋白質(zhì)注射劑和相關(guān)制劑進(jìn)行了補充說明，允許使用較小的測試產(chǎn)品體積來進(jìn)行不溶性微粒的檢測。對于沒有足夠體積的產(chǎn)品，可將適當(dāng)數(shù)量的產(chǎn)品混合在一個單獨的容器中，以獲得單次測試所需的體積(通常為0.2-5.0 mL)。AccuSizer A2000 系列儀器可以提供小體積檢測方案，以下檢測方案僅供參考：

通過與常規(guī)檢測方法的對比，我們建議在小體積檢測分析方法開發(fā)上可進(jìn)行如下改進(jìn)：①使用微升級別進(jìn)樣量、降低流速；②使用小體積注射器，保證體積精度；③重新校準(zhǔn)曲線保證數(shù)據(jù)精確度。

3）大多數(shù)高濃度抗體藥物需冷藏儲存，如采用較低溫度直接檢測，與管路中殘留不同溫度液體間將發(fā)生熱量傳遞，造成液流紊亂；

4）中美藥典均為≥10μm和≥25μm的顆粒制定了明確的標(biāo)準(zhǔn)限度，對于分子量較大的蛋白質(zhì)藥物，分子聚集之后產(chǎn)生的顆粒在免疫學(xué)方面存在隱患。Carpenter等人認(rèn)為0.1-10μm 范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)不溶性微粒潛在免疫原性風(fēng)險存在不確定性，測量<10 μm尺寸范圍內(nèi)的不溶性微粒物有助于產(chǎn)品開發(fā)和表征。^[5]

3.  現(xiàn)行光阻法的優(yōu)化方案

儀器優(yōu)化設(shè)計^[6]：光阻法顆粒計數(shù)儀器可通過儀器設(shè)計滿足不同的應(yīng)用目的。

1）如果在檢測器流通池不變的基礎(chǔ)上減少測樣體積，可通過如下方式：

• 取樣針的內(nèi)徑變小

• 取樣針的長度變短

• 減少取樣針尖與測樣容器底的距離

• 取樣針為平頭型設(shè)計

• 軟件中支持設(shè)置不同取樣體積，即包括最滴取樣體積

• 支持基于取樣針中心點的平底容器的傾斜放置樣品固定模塊

2）如果要減少測樣過程中氣泡的產(chǎn)生，設(shè)計如下

• 可調(diào)節(jié)抽取樣品速度

• 平頭取樣針

• 測樣流通池孔徑小于取樣針的內(nèi)徑

AccuSizer A2000 系列不溶性微粒檢測儀，采用PFA材質(zhì)進(jìn)樣管，進(jìn)樣管管內(nèi)內(nèi)徑可選，長度可調(diào)，可使用平頭取樣針，可用于不同規(guī)格的試劑瓶，軟件可以調(diào)節(jié)不同的進(jìn)樣體積，近透明的材質(zhì)更方便觀察是否抽取到氣泡。

A2000 系列單個傳感器檢測范圍為：0.5μm~400μm，傳感器濃度上限10000個/mL，具有512數(shù)據(jù)通道，分辨率高。模塊化設(shè)計，維護升級便利，如樣品檢測量多，可選配自動進(jìn)樣器，可實現(xiàn)全自動進(jìn)樣。

圖1 AccuSizer A2000 系列不溶性微粒檢測儀

4.  新型SbvP檢測方法

不溶性微粒的來源有多種，分辨微粒的來源有利于開發(fā)和應(yīng)用的控制策略，但常規(guī)SbvP檢測的光阻法無法辨別不溶性微粒的形態(tài)，無法確定微粒的來源。2017年USP40<1788>收錄不溶性微粒檢測第三法——流動成像法（Flow Imaging method, FIM），流動成像法結(jié)合微流體和光學(xué)顯微鏡技術(shù)，可快速大量地自動捕捉圖像，這些圖像可以用來分析生物治療樣品中顆粒的濃度、大小分布及形態(tài)。

聚集蛋白具有半透明、折光率低等特點，在使用光阻法（Light Obscuration method, LO）進(jìn)行不溶性微粒測試時，可能無法檢測出透明度較高、對光不敏感的蛋白粒子。對于聚集蛋白，流動成像法獲得的粒子濃度將比光阻法獲得的粒子濃度更準(zhǔn)確^[7]。但光阻法仍然是評估顆粒負(fù)荷的一個重要工具，因為：

1. 光阻法儀器具有高可靠性和可重復(fù)性；

2. 對非美國市場的監(jiān)管要求可能需要使用光阻法；

3. 藥品的光阻法測試有悠久的歷史和重要的積累的經(jīng)驗，測量的顆粒濃度的歷史值很容易與當(dāng)代的光阻法測量值進(jìn)行比較。

綜上所述，采用光阻法為主，流動成像法為輔的不溶性微粒檢測方法更有利于產(chǎn)品的開發(fā)和質(zhì)量監(jiān)控。

FlowCam8000系列流式成像顆粒分析系統(tǒng)

流式成像顆粒分析系統(tǒng)（FIM）將數(shù)字成像、流式細(xì)胞技術(shù)和顯微鏡的優(yōu)勢結(jié)合在單個解決方案中。除了測量傳統(tǒng)的粒子大小和數(shù)量，通過分析圖像還可以表征生物藥品、蛋白樣品、注射液、細(xì)胞、浮游微生物等中的亞可見顆粒（不溶性微粒）。

圖2 FlowCam 8000 流式成像顆粒分析系統(tǒng)

5. 在藥品全生命周期中對SbvP進(jìn)行監(jiān)管

早期研發(fā)階段和后期工藝階段可使用多種檢測方法對顆粒進(jìn)行全面的表征分析，對比不同方法間差異性，監(jiān)控顆粒的形成途徑，來源及變化趨勢，為處方工藝開發(fā)提供參考；

后期研發(fā)階段的重點是了解產(chǎn)品不同批次之間的可比性，以及顆粒結(jié)果與配方、制造和使用等因素之間的關(guān)聯(lián)性，如應(yīng)監(jiān)測臨床批次1~100 μm范圍內(nèi)的顆粒數(shù)量與大小；應(yīng)收集在儲存、使用和壓力條件下形成的不溶性微粒物的定量和定性數(shù)據(jù)，并制定風(fēng)險控制策略；在最終選擇監(jiān)測產(chǎn)品顆粒大小和計數(shù)的方法時，應(yīng)分別建立內(nèi)源性顆粒、外源性顆粒及固有性顆粒的控制策略。

藥典的監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn)是最滴標(biāo)準(zhǔn)，與對微粒危害的認(rèn)識和監(jiān)測需求相比具有滯后性，因此，在內(nèi)控時也應(yīng)嘗試從多種粒徑水平、多種檢測方法對顆粒進(jìn)行全面表征和分析，積累數(shù)據(jù)，以便為增加放行方法和提升放行要求提供依據(jù)，也為不良反應(yīng)原因回溯提供數(shù)據(jù)支持。^[8]如下是SbvP在產(chǎn)品生命周期內(nèi)的檢測策略，供參考。

表1 SbvP在產(chǎn)品生命周期內(nèi)的檢測策略^[6]

參考資料

[1] 淺析高濃度制劑開發(fā)面臨的挑戰(zhàn)和解決方案 || 抗體藥研發(fā)問答，抗體君（公眾號）

[2] BADKAR AV，GANDHI RB，DAVIS SP，et al．Subcutaneous delivery of high-dose /volume biologics: current status and prospect for future advancements［J］．Drug Des Devel Ther，2021，15: 159-170

[3] USP 1787

[4] USP 787

[5] Satish K Singh, Nataliya Afonina, Michel Awwad, et al. An Industry Perspective on the Monitoring of Subvisible Particles as a Quality Attribute for Protein Therapeutics[J]. Journal of Pharmaceutical Sciences，2010，99（8）： 3302-3321.

[6] 丁毅,張雅婷,郭歡歡,熊菲,紀(jì)仁智,邱波.高濃度抗體藥物制劑的亞可見顆粒檢測方法優(yōu)化和操作策略[J].中國新藥雜志,2022,31(08):762-766

[7] USP 1788

[8] 郭莎,賈哲,吳昊,王蘭.單克隆抗體顆粒表征的現(xiàn)狀與挑戰(zhàn)[J].中國藥事,2022,36(02):161-169.